1-aminociclopropano-1-carboxilato (ACC) desaminase em estirpes de Mesorhizobium: prevalência e efeito na simbiose com Cicer arietinum"

Abstract

A simbiose entre leguminosas e rizóbio é um dos principais contributos para a fixação biológica do azoto, constituindo uma alternativa ao uso de fertilizantes químicos. As cultivares de Cicer arietinum (L.) de sementeira antecipada Outono-Inverno são bastante susceptíveis ao encharcamento o que leva a uma redução da sua produtividade Em condições de encharcamento ocorre um aumento da concentração de etileno na planta que poderá levar à sua morte. Organismos que produzem a enzima 1-aminociclopropano-1-carboxilato (ACC) desaminase (E.C. 3.5.99.7) responsável pela degradação de ACC (precursor do etileno) em amónia e α-cetobutirato, são capazes de promover o crescimento de plantas através da redução dos níveis de etileno na planta. O principal objectivo deste estudo é a obtenção de estirpes de Mesorhizobium de grão-de-bico, transformadas com um gene acdS codificando a enzima ACC desaminase, promovendo assim o crescimento de grão-de-bico em condições normais e de encharcamento. Foi também estudada a prevalência de genes acdS em isolados nativos de Mesorhizobium de grão-de-bico. Neste estudo foram transformadas sete estirpes de Mesorhizobium por conjugação triparental. Através da expressão de um gene acdS exógeno, o isolado T-1-Telhado aumentou a sua capacidade de nodular grão-de-bico em 100% (em condições normais). A duplicação do número de nódulos resultou num aumento de cerca de 74% na biomassa total da planta de grão-de-bico. Não foi encontrada qualquer relação entre a actividade da enzima ACC desaminase e o complexo enzimático nitrogenase (E.C. 1.18.6.1) responsável pela fixação de azoto atmosférico. Em condições de encharcamento não se verificou qualquer aumento do crescimento da planta de grão-de-bico inoculada com a estirpe transformada. Ambas as estirpes, transformada e ―wild type‖, tiveram o mesmo comportamento. Em condições de encharcamento foram formados mais nódulos pela estirpe ―wild type‖ quando em comparação com o mesmo tratamento em condições normais. Estes resultados sugerem que em condições de stresse outros mecanismos de regulação da formação de nódulos poderão ser activados e que estes não estão associados aos efeitos do etileno. O gene acdS foi detectado pelo método de PCR em 11 dos 56 isolados estudados A análise filogenética demonstrou que estes genes são similares ao gene acdS de M.loti MAFF303099, o que sugere que estes possam ter sido adquiridos por transferência horizontal. A análise pelo método de hibridação de Southern revelou a presença de apenas uma cópia do gene acdS. Através do método de hibridação de Southern foram também detectados outros genes acdS que não foram detectados pelo método de PCR. Os resultados obtidos permitiram verificar pela primeira vez a presença de genes acdS em isolados das espécies M. tianshanense, M. amorphae, M. huakui, M. mediterraneum e M. ciceri; ABSTRACT: The symbiotic association between rhizobia and leguminous plants is one of the major contributors to the total biological nitrogen fixation, which is an alternative to the use of nitrogen fertilizers that lead to unacceptable pollution levels. Chickpea (Cicer arietinum L.) winter cultivars are very susceptible to waterlogging conditions, leading to the reduction of this crop productivity. Waterlogging conditions increase plant ethylene concentration which can cause plant death Organisms that produce the enzyme 1-aminocyclopropane-1-carboxylate (ACC) deaminase (E.C. 3.5.99.7), responsible for the conversion of ACC (the precursor of ethylene in plants) into ammonia and α-ketobutyrate, can promote plant growth by decreasing ethylene levels. The main goal of this study is to obtain chickpea mesorhizobia transformed with an ACC deaminase gene (acdS), capable of decreasing ethylene levels and subsequently increasing plant growth under normal and waterlogging conditions. The detection of acdS genes in a portuguese chickpea mesorhizobia collection was also studied. In this work, seven Mesorhizobium chickpea strains were transformed with a acdS gene by triparental conjugation. By expressing an exogenous acdS gene, the transformed strain T-1-Telhado increased its ability to nodulate chickpea by 100% when compared to the ―wild type‖ strain, under normal conditions. This ability to duplicate nodule number resulted in a 74% increase in chickpea total biomass. No significant relation was found between ACC deaminase and nitrogenase (E.C. 1.18.6.1) activity. Under waterlogging conditions there wasn’t any increase in plant growth promotion by the transformed Mesorhizobium strain. Both T-1-Telhado and T-1-Telhado pRKACC strains had the same behavior. Under stress conditions, more nodules were formed by the ―wild type‖ strain when compared to normal conditions. These results suggest that under stress conditions other mechanisms of nodule formation and regulation could be activated and they might not be associated with ethylene levels. The acdS gene was detected in 11 of 56 tested isolates, by PCR method. Phylogenetic analysis showed that these acdS genes were similar to M. loti MAFF303099 acdS gene, suggesting that these could be obtained by horizontal transfer. Southern hybridization analysis revealed that only one copy of the acdS gene is present in chickpea mesorhizobia strains. On the other hand, Southern hybridization analysis showed acdS genes undetected by the PCR method. This is the first report of the presence of an acdS gene in species of M. tianshanense, M. amorphae, M. huakui, M. mediterraneum and M. ciceri.