Determinação e Análise da Estrutura da Desulfoferrodoxina Isolada de Desulfovibrio desulfuricans ATC 27774

Abstract

"Sem resumo feito pelo autor"; - Da grande variedade de metaloproteínas que tem sido isolada de bactérias redutoras de sulfato várias têm já as suas estruturas tridimensionais conhecidas, nalguns casos tendo sido encontrados centros metálicos com novas características, noutros combinações invulgares de centros metálicos numa mesma molécula de proteína. O esclarecimento da relação estrutura-função para uma determinada proteína e, em particular, o estabelecimento do envolvimento do seu centro metálico na actividade biológica contribuem para a elucidação do metabolismo particular das bactérias redutoras de sulfato. Adicionalmente é possível prever da actividade funcional e do mecanismo de actuação de proteínas com características estruturais semellhantes. A cristalografia de raios-X por monocristal é utilizada na determinação de estruturas moleculares, em particular de proteínas, com resolução e rigor suficientes para permitir uma análise detalhada da estrutura molecular encontrada. Por isso, é amplamente utilizada em estudos deste tipo. Esta dissertação é iniciada com uma introdução onde se expõem os conhecimentos já adquiridos e o interesse subjacente aos estudos do metabolismo de bactérias redutoras de sulfato, nomeadamente, no que se refere ao envolvimento de certas metaloproteínas, proteínas não-hémicas com centros mononucleares de ferro, e em particular a desulfoferrodoxina. Esta proteína, cuja actividade biológica não foi ainda determinada, foi isolada de Desulfovibrio vulgaris e de Desulfovibrio desulfuricans. Estudos espectroscópicos efectuados antes desta determinação estrutural sugeriram a existência de dois centros mononucleares de ferro diferentes por monómero, sendo um deles do tipo desulforedoxina e o segundo coordenado na sua maioria por átomos de oxigénio e/ou azoto. A comparação estrutural do centro de ferro H desta proteína com outros centros do mesmo tipo motivou a apresentação de um breve resumo sobre as características estruturais de proteínas com centros mononucleares de ferro e multinucleares coordenados por átomos de azoto e enxofre. Na Parte H (Parte experimental) são descritos os procedimentos experimentais utilizados e os resultados obtidos durante a execução deste trabalho. A descrição de cada etapa do trabalho efectuado é, sempre que se julgou necessário, antecedida pela apresentação de um breve resumo dos aspectos teóricos aí envolvidos. Numa primeira fase é descrita a determinação da estrutura da desulfoferrodoxina utilizando dados de difracção de raios-X obtidos a partir de cristais romboédricos crescidos na presença de um agente oxidante e fases determinadas a 2.8 À pelo método de dispersão anómala a múltiplos comprimentos de onda, utilizando os átomos de ferro presentes na proteína nativa como dispersores anómalos. O modelo construído a partir do mapa de densidade electrónica calculado foi refinado a 1.9 Â. As coordenadas do modelo refinado são utilizadas para a determinação da estrutura da desulfoferrodoxina em cristais monoclínicos crescidos na presença do mesmo agente oxidante, recorrendo-se ao método de substituição molecular. É ainda efectuada a comparação de mapas de densidade electrónica calculados utilizando dados de difracção recolhidos para cristais obtidos na presença de um agente oxidante e de um agente redutor, com o objectivo de conhecer diferenças estruturais para dois estado de oxidação da desulfoferrodoxina, o oxidado e o semi-reduzido. Algumas implicações resultantes da análise da estrutura refinada da desulfoferrodoxina foram verificadas recorrendo às técnicas de espectrometria de massa e de emissão de protões induzida por raios-X. A terceira parte do trabalho (Discussão) é iniciada com a descrição e análise da estrutura refinada para cristais romboédricos de desulfoferrodoxina. Esta pode ser descrita como um homodímero constituído por dois domínios, cada um contendo dois centros não-hémicos mononucleares de ferro equivalentes por simetria cristalográfica. O domínio I, com dois centros de ferro do tipo-rubredoxina com geometria tetraédrica distorcida, é semelhante à estrutura da desulforedoxina. Os centros de ferro do domínio II têm uma coordenação em pirâmide quandrangular por quatro átomos de azoto de resíduos histidina que ocupam as posições equatoriais e um átomo de enxofre pertencente a um resíduo cisteína na posição axial. A sexta posição de coordenação é parcialmente ocupada por um ião hexacianoferrato. A elevada semelhança estrutural entre o domínio I da desulfoferrodoxina e a molécula de desulforedoxina e a forte interacção estabelecida entre monómeros devida à presença de três folhas 0 que se extendem ao longo do dímero, duas no domínio I e uma no domínio H, sugerem que a desulfoferrodoxina tem actividade funcional como dímero. A interpretação dos mapas de densidade electrónica e a natureza da vizinhança atómica são consistentes com a atribuição de um ião cálcio a um máximo de densidade electrónica existente na zona de interacção entre monómeros. O subsequente refinamento confirma esta interpretação. Abstract Several metalloproteins have been isolated from the sulphate-reducing bacteria. Among those of known tridimensional structure, some revealed new types of metal centres while others unusual combinations of centres. The understanding of the structure-function relationship of a protein, and in particular, the knowledge of the role of its metal centres in its biological activity allows the clarification of the unusual metabolism of the sulphate reducing-bacteria and the prediction of the functional activity and the reactional mechanism of proteins with structural similarities. To do this type of analysis molecular structures must be known with sufficient precision and detail. X-ray crystallography is still the most powerful technique used to solve tridimensional structures. If the crystals diffract to high resolution, than atomic detail can even be achieved. In the introduction, a brief review of studies on the sulphate-reducing bacteria metabolism is presented, in regard to some metalloproteins, in this case on non-heme proteins with mononuclear iron centres and, in particular, on desulfoferrodoxin. This protein, with unknown biological activity, was isolated from Desulfovibrio vulgaris and Desulfovibrio desulfuricans. Spectroscopic studies suggested that each monomer contains two different mononuclear iron centres, a desulforedoxin-type centre and an iron centre coordinated mainly by oxygen and/or nitrogen atoms. In this chapter a summary it is also presented of the structural characteristics of mononuclear non-herne iron centre proteins and of some proteins containing iron clusters coordinated by nitrogen and sulphur used for structural comparison with the desulfoferrodoxin iron centre II. In part H (Experimental) the experimental procedures used and the results obtained during this work are described. Before the description of each part of the work performed some theoretical aspects directly related with it are presented. The structure determination of desulfoferrodoxin by MAD phasing to 2.8 À resolution using diffraction data collected from rhombohedral crystals grown in the presence of an oxidizing agent is described. The iron atoms in the native protein were used as the anomalous scatterers. The model was built from an electron density map obtained after density modification and refined against data collected to 1.9 Â. The refined structure was used as a model in the determination of the monoclinic structure of desulfoferrodoxin by the molecular replacement method, using diffraction data collected for crystals grown in the presence of the same oxidizing agent. In order to determine structural differences between the oxidized and half-reduced states of desulfoferrodoxin, diffraction data was also collected from crystals grown in the presence of a reducing agent. Difference Fourier maps were calculated using these and the initial data measured from crystals grown in the presence of an oxidizing agent, and with phases obtained both by the MAD method and from the refined desulfoferrodoxin model. Some implications arisen from the structural analysis of the desulfoferrodoxin molecular model were confirmed using mass spectroscopy and proton induced X ray emission techniques. The third part of this work (Discussion) begins with the description and analysis of the refined rhombohedral desulfoferrodoxin structure, which can be described in terms of two domains, each with two crystallographically equivalent non-heme mononuclear iron centres. Domain I is similar to desulforedoxin, with distorted rubredoxin-type centres, and domain H has iron centres with square pyramidal coordination to four nitrogens from histidines as the equatorial ligands and one sulphur from a cysteine as the axial ligand. Domain I in desulfoferrodoxin shows a remarkable structural fit with the desulforedoxin homodimer. Furthermore, three, -sheets extending from one monomer to another in desulfoferrodoxin, two in domain I and one in domain H, strongly support the assumption of desulfoferrodoxin as a functional dimer. A calcium ion, shown to be indispensable in the crystallisation process, was assumed at the dimer interface and appears to contributo to dimer stabilisation. A 30% occupancy by a ferricyanide ion in the sixth coordination position of centre H is suggested. Desulfoferrodoxin coordinates were deposited on the PDB Data Bank with the accession code 1DFX. The refined models for desulfoferrodoxin in both crystalline forros, monoclinic and rhombohedral, are very similar. For the monoclinic structure the presence of a calcium ion in the dimer interface and the partial occupancy of the sixth coordination position of centre H in monomer B by a ferricyanide ion is also observed. Both the comparison between the diffraction data collected for crystals with the centre H in the two oxidation states and the amount of iron present in desulfoferrodoxin crystals, as determined by the proton induced X ray emission technique, support the previous proposal.