Prevalence of anthelmintic resistance in Portuguese sheep populations and efficacy of redox natural compounds as anthelmintic enhancers

Abstract

Gastrointestinal nematodes (GINs) pose a significant threat to small ruminants globally, particularly sheep, where heavy infections impair growth, reduce meat, milk, and wool yields, and increased mortality rate. In Portugal, these losses are estimated to be €6 million annually. Traditional control via anthelmintic drugs, especially benzimidazoles (BZs) like albendazole (ABZ) and thiabendazole (TBZ), is increasingly compromised by widespread anthelmintic resistance (AR), endangering sustainable livestock production. This thesis addressed four objectives: (1) mapping regional BZ AR patterns on Portuguese sheep farms; (2) identifying GIN species and their relative prevalence; (3) quantifying BZ-resistance allele frequencies; and (4) evaluating natural aromatic phytochemicals as BZ enhancers to mitigate AR. Egg hatch tests (EHTs) assessed AR to ABZ and TBZ across 35 farms by calculating effective concentrations inhibiting 50% egg hatch (EC50). ITS2 rDNA metabarcoding profiled GIN species and abundances in nemabiomes. Isotype-1 β-tubulin gene metabarcoding targeted single nucleotide polymorphisms (SNPs), notably F200Y, linked to BZ resistance in Haemonchus contortus. Checkerboard EHTs on nemabiomes from 14 farms tested synergistic interactions between phytochemicals (EC10-EC75) and BZs (EC10- EC50). BZ AR was detected in 69% of farms, with TBZ resistance more prevalent. Ten GIN species dominated, led by H. contortus (north), Teladorsagia circumcincta (south), and Trichostrongylus colubriformis. Elevated BZ EC50 values correlated with high F200Y SNP frequencies in H. contortus β-tubulin, peaking in Alentejo (>90% homozygosity). Among eight phytochemicals, trans-cinnamaldehyde (EC90: 27.0 μg/mL) and octyl gallate (54.1 μg/mL) exhibited strongest standalone potency. BZ-phytochemical mixtures demonstrated synergy, drastically reducing required BZ doses and surmounting AR thresholds. This study reveals extensive, regionally variable BZ AR in Portuguese sheep GINs, driven by nemabiome composition and genetic markers. BZ-phytochemical synergies offer a novel, low-resistance strategy, potentially via eggshell disruption enhancing BZ uptake, β-tubulin disruption, or oxidative stress induction. Urgent integrated parasite management, prioritizing Alentejo, is essential to safeguard small ruminant industries in Portugal; - Prevalência de resistência anti-helmíntica em populações ovinas portuguesas e eficácia de compostos naturais redox como potenciadores anti-helmínticos Resumo Os nemátodes gastrointestinais (NGIs) ameaçam globalmente a produção de pequenos ruminantes, comprometendo a produção de carne, leite e lã, e aumentando a mortalidade. O controlo baseado em antihelmínticos, principalmente benzimidazóis (BZs), como albendazol (ABZ) e tiabendazol (TBZ), fragiliza a sustentabilidade da produção pecuária, devido à resistência anthelmíntica (AR). Esta tese visou: mapear a AR a BZs em explorações de ovinos portuguesas; determinar a prevalência de espécies de NGI; quantificar alelos de resistência a BZs; (4) avaliar fitoquímicos aromáticos naturais como potenciadores de BZs. A AR a ABZ e TBZ foi avaliada por testes de eclosão de ovos (EHTs) em 35 explorações, com base na dose efetiva 50% (EC50). As espécies e abundâncias de NGI em nemabiomas foram caracterizadas por metabarcoding ITS2 rDNA, enquanto o metabarcoding do gene β-tubulina isótipo-1 identificou SNPs, como F200Y, associados à resistência em Haemonchus contortus. As sinergias entre fitoquímicos (EC10-EC75) e BZs (EC10-EC50) foram avaliadas por EHTs, com ensaios matriz, em nemabiomas de 14 explorações. Detetou-se AR a BZ em 69% das explorações, principalmente a TBZ. EC50 elevadas a BZ correlacionaram com elevadas frequências de SNP F200Y no gene da β-tubulina de H. contortus, sobretudo no Alentejo (>90% homozigosidade). Entre oito fitoquímicos, trans-cinnamaldeído (EC90: 27,0 μg/mL) e octil galato (54,1 μg/mL) mostraram a maior potência isolada. As misturas BZ-fitoquímico evidenciaram sinergia, reduzindo drasticamente as doses de BZ e superando os limiares de AR. Este estudo revela AR a BZ extensa e variável regionalmente em NGIs de ovinos portugueses, influenciada pela composição do nemabioma e marcadores genéticos. As sinergias BZ-fitoquímico oferecem uma estratégia inovadora de baixa resistência, possivelmente aumentando a captação de BZ por disrupção da parede do ovo, perturbação da β-tubulina ou indução de stress oxidativo. O controlo integrado urgente das parasitoses, priorizando o Alentejo, é crucial para proteger a indústria de pequenos ruminantes em Portugal.