Localização subcelular do novo fotossensibilizador em células do melanoma ocular através de microscopia confocal

Abstract

Introdução: O melanoma ocular é o objetivo de várias investigações em medicina e medicina veterinária devido à baixa taxa de resposta aos tratamentos conservadores convencionais1. A terapia fotodinâmica (PDT) é uma terapia mais conservadora para os tecidos não neoplásicos, que induz e ativa as vias de morte celular nos tecidos neoplásicos alvo2,3. O fotossensibilizador, luz e oxigenio são os três componentes vitais não tóxicos da reação fotodinâmica. Quando o fotossensibilizador é ativado por uma fonte de luz (600-800 nm), ocorre a produção de espécies reativas de oxigenio (ROS) que exerce efeito terapêutico sobre a neoplasia2. A oxidação irreversível leva à morte da célula tumoral por apoptose, necrose e autofagia2. A morte celular pode ser ativada pela via extrínseca, que envolve recetores da membrana plasmática, ou pela via intrínseca, em que a mitocôndria tem um papel central2,3. A localização subcelular dos fotossensibilizadores constitui o local de dano primário da terapia fotodinâmica e é determinante nas vias de atuação ativadas pela reação fotodinâmica3. Recentemente, desenvolvemos um grupo de novas clorinas, que são fotossensibilizadores muito eficazes em células de melanoma2,3,4. Dessa forma o objetivo do trabalho foi avaliar a localização subcelular (núcleo e mitocôndria) da nova clorina em células do melanoma ocular. Métodos: Células da linha celular de melanoma ocular (MP-41) cultivadas em meio RPMI com 25% de FBS, foram semeadas em placas de 24 poços com lamelas esterilizadas. As células foram incubadas com 500 nM da nova clorina (derivado dihidroximetilo de 4,5,6,7-tetra-hidropirazolo[1,5-a]piridina fundido com tetrafenilclorina) por 24 h. Após este período, as culturas foram submetidas a duas lavagens com PBS, de modo a remover todo o fotossensibilizador no exterior das células, e procedeu-se à marcação dos organelos. As células que foram marcadas com o corante nuclear Hoechst 33252 (blue) e incubadas com uma solução de 5 μg/ml da sonda em PBS durante 15 minutos no escuro. As culturas celulares que foram marcadas com a sonda mitocondrial MitoTracker® Green FM foram incubadas com uma solução de 200 nM da sonda em PBS durante 30 minutos, a 37ºC, no escuro. Após as incubações com as respetivas sondas as células foram lavadas com PBS as lamelas foram montadas sobre lâminas e observadas ao microscópio confocal (Carl Zeiss MicroImaging LSM710, objetiva 40X) e fotografadas. As imagens foram analisadas no software ImageJ e a colocalização avaliada pelo coeficiente de correlação de Pearson. Resultados: Os estudos de localização subcelular confirmaram a internalização celular do novo fotossensibilizador. A média para coeficiente de Pearson foi -0,114 para colocalização núclear, certificando a existência 43% de correlação negativa, para as imagens analisadas, demostrando que não ocorre internalização nuclear do novo fotossensibilizador. No que respeita a mitocôndria, verificou-se a existência de 66%, correlação de Pearson positiva, que foi igual a média 0,366 para as imagens analisadas, demostrando que ocorre internalização mitocondrial do novo fotossensibilizador. Conclusão: Verificou-se que o novo fotossensibilizador é captado pelas células de melanoma ocular e que se acumula nas mitocôndrias, mas não penetra no núcleo celular.